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引物纯化、稀释、保存

一、引物纯化

◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶剂洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。但它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响,但是用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

◆OPC纯化: OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。

◆PAGE纯化:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。三博远志用PAGE纯化,纯度达98%。

◆HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于长链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。

二、引物纯化方式

 

一、引物纯化方式
应 用

引物长度要求

纯度级别要求

一般PCR扩增

< 45base

OPC

一般PCR扩增

>45 base

PAGE

诊断PCR扩增

< 40base

OPC, PAGE

DNA测序

20base左右

OPC

亚克隆,点突变

根据实验要求定

OPC,PAGE,HPLC

基因构建

根据实验要求定

OPC,PAGE,HPLC

全基因合成

根据实验要求定

PAGE

反义核酸

根据实验要求定

PAGE

修饰引物

根据实验要求定

PAGE,HPLC

三、引物溶解稀释

1.干粉引物溶解稀释方法:

收到引物后,在开启离心管盖前在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟,以防开盖时引物干粉散失。引物保存在高浓度的状况下比较稳定。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融。引物一般配制成10-100pmol/ul(umol/l)。

三博远志的引物在出厂时都标有1OD 相当于多少umol 的计算结果,进行稀释时的引物加水量可以按以下公式计算:

稀释成100pmol/ul 1OD 需加水量(ul)=1OD相当于umol 数×10000

例如,您拿到的引物DNA合成报告单上标有1OD≈0.0035umol ,包装量是1OD/管,如果您希望将引物浓度定为100umol/L,那么只需用35ul无核酸酶的双蒸水将1OD的引物干粉溶解即可。

2.液体引物再稀释可用下列公式:

稀释引物要达到的浓度(pmol/ul)=母液浓度(pmol/ul)×汲取母液的体积(ul)÷(汲取母液的体积(ul)+加水量(ul))
四、引物保存

◆干燥制品很稳定,常温下数个月无问题。但为保证万无一失,最好放置于- 20 ℃保存;

◆溶解后的溶液DNA短期内(1~2 周)使用可放置在4 ℃下,长期保存请放置于- 20 ℃;溶解DNA时,请注意使用无菌、无核酸酶的水或TE Buffer;

◆如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融;

◆荧光标记引物请避光保存。   

 

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