首页 >> 基因检测 >> 基因检测方法比较及一代测序的优势

 三博因检测典型案例

基因检测的常用方法主要有:一代测序法、荧光定量 PCR Taqman 探针法、普通PCR法、质谱法、芯片法、二代测序法

 普通PCR法:                                                

对所检测的片段扩增,然后检测其大小和缺失情况,适用范围窄。

荧光定量 PCR Taqman 探针法:

对所检测的片段扩增,用探针检测是否有突变,准确性较好,适合于大量样本、少量位点,价格贵,缺点是不能读出序列,不太直观,是三博远志公司辅助使用的检测方法。

二代测序和一代基因芯片法:

最大优点是成本低廉,只相当于一代Sanger测序价格的1%,适合于超多基因,大量样品检测和科研筛查,每个样本做几百个位点和做几千个位点的检测成本相差无几,其次是操作简单。缺点是出来的大量数据,分析繁重,会掺入主观臆断因素,可重复性不好,易出现假阳性和假阴性,从而误导被检测者。

1、二代测序和Sanger测序方法有两点不一样(见下表)

1)二代测序法是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子,然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库,获得测序模板;

2)用大于Sanger测序几十倍的成数进行小片段测序,然后根据重叠的部分用软件自动寻找组装拼接。

2、造成二代测序实验结果的偏差的原因:

1)建库环节非常容易出现污染(对实验室要求很高);

2)无限倍扩大、扩增过程中由于不同基因的偏好性,会失真会偏差;

3)二代测序100bp,短片段拼接,会拼错位置,Sanger测序长度800bp无需拼接;

4)对比、分析、推理、出报告环节,会掺入主观臆断,不够客观。

3、一代芯片测序在标记、杂交环节容易出问题:

电子信号识别会把没有杂交上去的失败实验判定为阴性,由于样品问题和操作问题可能会出现较大假性结果概率,同样像二代测序一样有对数据进行对比、分析、推理、出报告的环节,会带入主观臆断成分,造成实验结果可重复性不好。Sanger测序是直接测序,排除了二代测序和一代芯片测序不准确的因素。

Sanger测序法及优势:北京三博远志公司基因体检主要使用的检测方法。

是美国基因科学家Sanger,于1977年建立,他本人也因此而获得了诺贝尔奖。该技术至今已用三十八年,现在已相当成熟完善。美国ABI公司的3730型全自动遗传分析仪,是经过国际和国家认证的仪器,可重复性达到100%,是亲子鉴定和法医鉴定的专用仪器。该方法是目前基因检测的国际金标准。

1、优点是精准,流程细致,质控环节多,污染低,结果直观可视,假性结果极低。可进行个性化基因检测。经过38年发展现在已非常完善成熟。

2、可进行个性化位点检测,可以任意选择单项测序,Sanger测序个性化基因检测有价格优势。由于临床测序特点是:“目标明确、结果精准、通量小”,Sanger 测序非常适用于临床。

3 缺点是通量小,成本高,比芯片或高通量检测高100倍。

 

实验案例:

三博基因公司常年承接新一代测序验证工作,二代测序和一代芯片测序有时失真很厉害,客户反映:“大量测序二代便宜,但有时物种都会搞错,只好用Sanger测序从头再测”。有的用二代测序筛查遗传病,查不出问题,返回来找一代Sanger测序重测。有的公司用一代芯片做大套餐的易感基因检测,结果非常雷同,检测不出什么实质问题。

二代芯片重复性不高的案例:我们曾把同一个人的样品,寄到23andme和国内XXX公司,做同样套餐项目(两家用同样的仪器,相同测序技术、同样的检测内容),对比其结果相似性只有60%左右,而一代Sanger测序结果一般和预期是一致的。

美国23andMe 公司使用的 Illumina公司的Solexa测序平台, 201311月份被叫停,2015年,美国FDA依旧没有解除对23andMe的限制,理由是“疾病检测具有一定风险,万一检测失误,人们由于恐惧将来会得乳癌,就切除了乳房。人们的健康损失、谁来担此责任?都成了不得不考量的问题。既然是医疗设备,就要受到监管……”。

 

Sanger测序与其他测序方法流程、准确度对比表

 

测序流程

结果

准确度

普通PCR

DNARNA提取制备

PCR有限扩增

 

 

 

 

 

看片段大小和有无

精度不高应用范围窄

荧光定量Taqman探针法

DNARNA提取制备

标记引物PCR有限扩增

 

 

 

 

 

看扩增有无片段

不太高

二代测序

DNARNA提取制备

DNA随机切割成小片段

末端连接上接头制成文库

微乳液

PCR

电泳测序获得小片段序列

大量小片段筛选拼接组装

对比分析推理出报告

依据众多100bp序列拼接分析推理组装的序列

受外部条件影响大有待提高

一代芯片

DNARNA提取制备

核酸标记

杂交

洗脱、染色

扫描芯片

对比分析推理出报告

 

设想预置突变位点电子信号推理结果

受外部条件和序列影响大,有待提高

Sanger测序

DNARNA提取制备

PCR有限扩增纯化

单引物PCR测序反应筛选

毛细管长片段电泳检测

质检,出具报告

 

 

连续可视的峰图和800bp序列

精准


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