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引物合成原理

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要是由ABI/PE 公司生产。引物合成的原理基本相同,主要差别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时的不同。北京三博远志生物技术公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪和美国biosearch公司产的板式高通量 192道合成仪。

        亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是沿待合成引物的3‘端向5‘端合成,相邻的核苷酸通过3‘→5‘磷酸二酯键连接。

        第一步,三氯乙酸和预先连接在固相载体(CPG)上的核苷酸反应(其活性基团处于被保护状态),脱去核苷酸5‘-羟基的保护基团DMT,获得游离的5‘-羟基;

        第二步,合成DNA的原料(亚磷酰胺保护的核苷酸单体)与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3‘端被活化,5‘-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5‘-羟基发生缩合反应;

        第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5‘-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉;

        第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

        经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5‘-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

        通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩、脱盐,测定OD260定量,根据定单要求分装。

 

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